外膜ユリソームは腸内でのグリカンの取り込みを仲介する

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バクテロイデスはヒト微生物叢の豊富なメンバーであり、遠位腸で食物および宿主由来の無数のグリカンを利用します1。これらの細菌の細菌外膜を介したグリカンの取り込みは、膜に埋め込まれたバレルとリポタンパク質の蓋で構成される SusCD タンパク質複合体によって媒介され、基質の結合と輸送を促進するために開閉すると考えられています。しかし、表面に露出したグリカン結合タンパク質とグリコシド加水分解酵素も、大きなグリカン鎖の捕捉、処理、輸送において重要な役割を果たします。外膜におけるこれらの成分間の相互作用は、結腸微生物叢による栄養素の獲得にとって重要であるにもかかわらず、ほとんど理解されていません。今回我々は、バクテロイデス・シータイオタオーミクロンのレバン利用システムとデキストラン利用システムの両方について、追加の外膜成分がコアのSusCDトランスポーター上に集合し、ユティソームと呼ばれる安定したグリカン利用マシンを形成することを示す。基質の非存在下および存在下での単粒子極低温電子顕微鏡構造は、基質捕捉のメカニズムを実証する協調的な構造変化を明らかにし、ユティソームの各成分の役割を合理化します。

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この研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて対応著者から入手できます。クライオ EM 再構成と対応する座標は、それぞれ電子顕微鏡データバンクと PDB に登録されています: 基質を含まないレバンユティリソーム (EMD-15288 および PDB 8A9Y)、FOS DP 8 ～ 12 を含むレバンユティリソーム (EMD-15289 および PDB) 8AA0)、FOS DP 8 ～ 12 を使用したレバンユティリソームからの SusC2D2 コア (EMD-15290 および PDB 8AA1)、FOS DP 15 ～ 25 を使用した非アクティブなレバンユティリソーム (EMD-15291 および PDB 8AA2)、FOS を使用した非アクティブなレバンユティリソームからの SusC2D2 コアDP 15 ～ 25 (EMD-1592 および PDB 8AA3)、デキストランユティリソームコンセンサス精製 (EMD-15293 および PDB 8AA4)。 GHlev の X 線結晶構造解析実験から得られた座標と構造因子は、アクセッションコード 7ZNR および 7ZNS で PDB に登録されています。質量分析プロテオミクスデータは、データセット識別子 PXD034863 とともに PRIDE パートナーリポジトリ経由で ProteomeXchange コンソーシアムに寄託されています。この研究の生データは、リーズ大学データリポジトリ: https://doi.org/10.5518/1329 で入手できます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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JBRW は、ウェルカムトラストの 4 年間の博士課程学生制度 (215064/Z/18/Z) によって支援されました。 BvdB は Wellcome Trust Investigator award (214222/Z/18/Z) によって財政的に支援されており、AS と YZMF はニューカッスル大学の学生制度によって支援されています。我々は、ビームタイム (提案 mx306、mx1221、mx13587 および mx18598) に関してダイヤモンド光源 (イギリス、ディドコット) に感謝し、ビームライン I02、I03、I04 および I24 のスタッフのサポートに感謝します。すべてのクライオ EM は、リーズ大学とウェルカムトラスト (108466/Z/15/Z および 221524/Z/20/Z) から資金援助を受けたアストベリー生物構造研究所で実施されました。電子顕微鏡検査のサポートについては、R. Thompson、E. Hesketh、D. Maskell に感謝します。プロテイン ID 質量分析は、リーズ大学質量分析施設で実施されました。この分析を実施してくれた J. Ault と R. George に感謝します。オープンアクセスを目的として、著者は、この投稿から生じた著者が承認した原稿バージョンに CC BY 公共著作権ライセンスを適用しています。

これらの著者は同様に貢献しました: Joshua BR White、Augustinas Silale

アストベリー構造分子生物学センター、リーズ大学生物科学部、リーズ、英国

ジョシュア BR ホワイト & ニール A. ランソン

英国ニューカッスル・アポン・タイン、ニューカッスル大学医学部バイオサイエンス研究所

オーガスティナス・シラーレ、マシュー・フィーシー、ティアン・ヒューニス、イーリン・ジュー、ホン・ジェン、アクシャダ・ガジビエ、スーザン・ファーバンク、アルノー・バスレ、マティアス・トロスト、デヴィッド・N・ボラム、バート・ヴァン・デン・バーグ

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JBRW は、NARAS 精製タンパク質の監督下でクライオ EM を実施し、クライオ EM 構造を決定し、BvdBMF 精製タンパク質の監督下で X 線結晶構造を決定し、ITC を実施しました。 YZ はプロテオミクス用の OM サンプルを準備しました。 TH と AG は、MTHZ の監督のもとでプロテオミクスを実施し、DNBSF の監督のもとで Bt1760 を精製し、Bt1760 の X 線結晶構造解析データを収集しました。 AB は Bt1760 の結晶構造を解明し、ニューカッスル構造生物学研究所を管理しました。 BvdB は B.theta 株を生成し、タンパク質を精製し、Bt1761 を結晶化しました。 JBRW、AS、DNB、BvdB、NAR が原稿を執筆しました。

バート・ヴァン・デン・バーグまたはニール・A・ランソンとの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature は、この研究の査読に貢献してくれた Mirjam Czjzek 氏、Stephen Withers 氏、その他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

(a) PUL 内の相対的な遺伝子の位置と機能を示すレヴァン PUL の構成。 4 つの OM 関連 PUL コンポーネント (SusClev、SusDlev、GHlev、および SGBPlev) が灰色のボックスで強調表示されます。 GHlev (Bt1760; GH32 エンドレバナーゼ) の X 線構造を示します (青色; PDB-ID: 7ZNR)。 SGBPlev (Bt1761) の AlphaFold2 予測モデルは、N 末端が下部にあり、提案された (C 末端) レバン結合ドメインが上部にあるような向き (ピンク色) で示されています。 GHlev および SGBPlev の N 末端は脂質化され、OM の外側リーフレットと結合することに注意してください。二量体 SusCDlev 複合体の開環状態における低温 EM 構造を示します (SusClev は緑色、SusDlev は灰色)。 (b) 機能が標識された遺伝子座内の遺伝子位置を示すデキストラン PUL の構成。 OM 関連の PUL コンポーネントは灰色の枠で囲まれています。 GHdex (Bt3087; GH66 エンドデキストラナーゼ)、推定上の SGBPdex (Bt3088)、および SusCDdex 複合体の AlphaFold2 予測モデルは、(a) のレバン PUL と同様に色付きで示されています。 (c) 煮沸前 (アスタリスク) と煮沸後の LDAO 精製 SusCDlev10 の以前に研究されたサンプルの SDS-PAGE。煮沸したサンプルには、SusClev および SusDlev のバンドに加えて 2 つの弱いバンドが示されており、これらは後に質量分析により GHlev および SGBPlev であると特定されました。 (d) レバン SusC2D2 コア複合体の 3D 分類中に得られたクラス平均。 SusC コンポーネントと SusD コンポーネント (それぞれ緑色と灰色) が密度にドッキングされます。密度の大きな領域は未割り当てのままです (オレンジ色)。 (e) 剛体として EM 密度 (青) にフィットした GHlev の結晶構造 (青の漫画) を持つ、以前に割り当てられていない密度の分離図。したがって、残りの濃度は SGBPlev によるものであり、マゼンタで色付けされています。

ソースデータ

(a) apo utilisome データの 3D 分類の最初のラウンドの出力。黄色、紫、ピンクのクラスは八量体複合体、つまり完全な八量体ユリソームを表します。緑色のクラスは、たった 1 つの SusC ユニットに関連する追加のリポタンパク質を示し、青色のクラスは、少量の SusC2D2 コア複合体が存在することを示します。 (b) FOS DP8-12 の存在下での活性レバナーゼによるレバンユティリソームの 3D 分類の出力。完全な八量体複合体の粒子を含むクラス（膜面で見た）（青と緑）、およびSGBPlevおよびGHlevの単一コピーを含む六量体複合体（ピンクと黄色）が観察されました。 SusCDlev を単独で含むクラスも存在します (紫色)。 (c) SGBPlev が SusD とレバナーゼの両方に近位で「ドッキング」構造をとることができることを示す長い FOS (DP15-25) の 3D 分類の出力。 (d) 少なくとも 1 つのドッキング SGBP (パネル (c) の黄色、ピンク、シアン、緑色) を含むすべてのクラスのコンセンサス改良。関心領域 (透明な黄色) の周囲にマスクが作成されました。 (e) アライメントなしでマスクされた領域に焦点を当てた分類の出力。関心領域の高解像度を表示するクラスには赤いアスタリスクが付いています。独立したハーフマップは、このクラスに属するマスクされていない粒子を使用して再構築されました。 (f) SGBPlev の密度が向上していることを示す、前述のハーフマップで生成された鮮明な再構成。

(a) 細胞の外側から見たアポレバンユリソームの 3D 分類。 SusClev (緑)、SusDlev (グレー)、SGBPlev (マゼンタ)、および GHlev (青)。クラスは SusDlev の蓋の位置によって分けられます。ワイド-ワイド（WW）、ノーマル-ワイド（NW）、ノーマル-ノーマル（NN）のオープン状態（左から右へ） (b) ワイド (SusD グレー) とノーマル (SusD オレンジ) のオープン状態の重ね合わせ複雑な。 (c) SusDlev をクライオ EM 密度に剛体フィットさせることによって生成された、通常状態と広く開いた状態の原子モデルのオーバーレイ。明確にするためにモノマーが示されており、両方のモデルで同じ SusDlev ヘリックスをアスタリスクでマークしています。 (d) 膜面の高閾値で示されたユリソームの図 (左)。 3D 分類で観察された SGBPlev のさまざまな立体構造を重ねて、このサブユニット (ボックス領域) の柔軟性を示します。同じビューを 90 度回転したものを示します (右)。乱れたミセル密度は半透明の灰色で示されます。（ e ）短いFOS（〜DP8〜12）および活性なGHlevを有する基質結合ユティリソーム、および不活性なGHlevを有する長いFOS（DP15〜25）におけるSGBPlev位置の変動。新しい状態は、長い FOS 構造で独特に観察され、1 つの SGBPlev (オレンジ色) が、ドッキング状態で存在する他の SusC サブユニットに関連する SGBPlev を横切って接触しています。この立体構造は、基質の同じ鎖と相互作用するユリソーム内の両方の SGBPlev サブユニットと一致します。

a、levan utilisome における SusC 上の GHlev と SGBPlev の配置。 GHlev は細胞外ループ 1 (金) および細胞外ループ 9 (赤) と接触しますが、SGBPlev は細胞外ループ 1 とのみ接触します。 b、デキストランユリソームの SusC 上の GHdex および SGBPdex の配置。ここで、SusCdex の細胞外ループ 1 は GHdex の主な相互作用部位であり、細胞外ループ 9 は SGBPdex とのインターフェースを構成します。明確にするために、各ケースでユティソームの半分が示されており、SusD コンポーネントは省略されています。デキストランユティリソームモデルは、クライオ EM 構造 (SusCdex) と AlphaFold2 からの予測モデル (GHdex および SGBPdex) の複合体であることに注意してください。

七量体デキストランユリソームマップの側面図 (a) と上面図 (b)。デキストランユリソームの複合原子モデルの同一の側面図 (c) と上面図 (d) を示します。 CryoEM データにより、SusCdex の改良が可能になりました。 SusDdex および GHdex の AlphaFold2 構造予測は、七量体複合体の cryoEM マップにドッキングされました。 SGBPdex の一部に対する AlphaFold2 構造予測も、cryoEM マップに適合しました。明確な密度は SGBPdex の最初の 2 つのドメインでのみ表示され、予測されたモデルは C 末端ドメインの前で切り詰められました。 SusCdex = 紫、SusDdex = ピンク、GHdex = シアン、SGBPdex = 緑。七量体複合体の精製では、3.1 Å のグローバル分解能が得られました。 (e) 3D 分類の洗練された出力。各マップは、(ラベル付きの) 補助コンポーネントの一意の補完または配置に対応しています。 (f) 2 つのアポグリカンユティリソームのアーキテクチャの概略図。レヴァンユティリソーム (左) は本文と同じ色です (SusClev = 緑、SusDlev = グレー、GHlev = 青、SGBPlev = マゼンタ)。基質を含まないデキストランユリソームの同等の図式は右側にあります。レバン系およびデキストラン系では、SusD に対して GH および SGBP 成分の配置が異なることに注目してください。

(a) アクティブな GHlev と短い FOS (DP8-12) を含むレバンユティリソームデータセットから得られた分離 FOS 密度。基質 (黄色) の濃度は、高しきい値 (左) と低しきい値 (右) で表示されます。 (b) 不活性な GHlev と長い FOS (DP15-25) を含むユティソーム構造から得られた分離 FOS 密度。レバン密度 (オレンジ色) は、高しきい値 (左) と低しきい値 (右) で表示されます。矢印は、(a) に比べてフルクトース分岐が欠落していることを示します。 FOS1 部位では、Frc4 上の推定上の β2,1 装飾の密度が欠落しています。逆に、連続した密度は、FOS2 で以前に解析された密度を超えて広がり、Frc5 には新しい β2,1 装飾が見られます。 FOS2 部位に結合する基質も同様の傾向に従い、以前にモデル化された β2,1 結合フルクトース側鎖は FOS が長くなるとはるかに弱くなりますが、別の β2,6 結合モノマーによる密度の増加により鎖が FOS1 部位に向かって伸びます。より高い閾値レベルでは、密度が FOS1 結合部位と FOS2 結合部位を結び付けており、より長い FOS (~DP15) が両方の部位を同時に占有することができることを示しています。接続密度は弱く、複数の立体構造を示しており、SusClev からこのセグメントへの接触が存在しないことと一致しています。これらのデータは、トランスポーターがかなりの基質結合性を有し、以前に示唆されたように、比較的長い FOS (約 15 DP) に対応できることを裏付けています 12。示されている FOS モデルは、短い FOS (DP6-12) の存在下で決定された SusCDlev 複合体の元の X 線結晶構造からのものです12。 (c) 2 つの結晶構造 (7ZNR および 7ZNS; オレンジ、灰色) と重ねられた、FOS が結合した不活性 GHlev のクライオ EM 構造 (青色)。 (d、e) GHlev の FOS3 (活性部位) と FOS4 (二次) 結合部位に結合した FOS の比較。矢印は、おそらくクライオ EM よりも共結晶化に低い DP FOS を使用した結果として、結晶構造内の FOS 鎖の切断を示しています。 (d) と (e) のビューは重ね合わせから生成されます。

(a) 1 mM の規定長 FOS の 50 μM 野生型 SGBPlev への滴定は、完全な親和性には約 15 フルクトース単位が必要であることを示唆していますが、これは WAWA (W297A/W359A) 変異によって無効になります。 (b) 8 mg/ml レバン、イヌリンまたはデキストラン 500 の 50 μM SGBPlev への ITC 滴定は、レバンに対するその特異性を示します。 (c) GHlev バリアントの力価測定からの ITC データ (すべての不活性 D42A GHlev バックグラウンドでアラニンに変異した残基を示します)。 Levan (8 mg/ml) を、50 μM の示された GHlev バリアントに滴定しました。データフィッティングの仮定は方法で説明されています。 (d) GHlev モデルの表面表現。FOS は黄色の棒で示されています。挿入図は、FOS3 (活性部位) および FOS4 (二次) 結合部位の拡大図であり、FOS3 の漫画表現の原子モデルが芳香族残基 (Y70A、W318A) の側鎖とともに示されています。二次結合部位の場合、これらの残基は W217A、F243A、Y437A です。

ソースデータ

a、概要、および b、SGBPlev FOS 結合部位の拡大図。 FOS と相互作用すると考えられる芳香族および極性残基は、灰色の棒モデルとして示されています。 SGBPlevのクライオEM構造は、選択されたホモログAlphaFold2予測モデルと一致しました（c〜f）。 c、バクテロイデス属。 D2 SGBPlev (UniProt E5CCB3)。 d、プレボテラ・オラリス ATCC 33269 SGBPlev (E7RM14)。 e、Flavobacterium commune SGBPlev (A0A1D9P8I4)。 f、F. セルロシリチカム SGBPlev (A0A4R5CJN9)。 bのものと同等のFOS結合残基は、灰色の棒モデルとして示されています(存在する場合)。 SGBPlev クライオ EM モデルの FOS チェーンを参考のために b ～ f に示します (オレンジと赤)。各パネルに示された同一性は、B.シータ由来のSGBPlevと比較して、C末端レバン結合ドメイン配列のみに対応する。どの SGBPlev 残基が FOS と水素結合を形成しているのかをクライオ EM マップから自信を持って特定することはできませんでしたが、結合部位保存分析により、SGBPlev の N295、T350、Q352、および N384 が FOS 結合に関与している可能性が高いことが示されました。ここで示すモデルのアミノ酸配列のアラインメントは、補足図 3 にあります。

このファイルには補足説明、図が含まれています。 1 ～ 4 および参考資料。

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転載と許可

ホワイト、JBR、シラレ、A.、フィーシー、M. 他外膜ユティリソームは、腸内バクテロイデスにおけるグリカンの取り込みを媒介します。自然 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41586-023-06146-w

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受信日: 2022 年 7 月 8 日

受理日: 2023 年 4 月 27 日

公開日: 2023 年 6 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06146-w

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